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Q&A

セルソーター

サンプル調製

Question Answer
使用できる蛍光色素の組み合わせを教えてください。

代表的な蛍光色素と光学フィルター設定の表は下記PDFファイルをご確認ください。同一のフィルターの蛍光色素は同時には使用できません。

細胞の濃度はどれくらいに調製すればよいですか? 1~5×10^6cells/ml程度を目安に調製してください。サンプルが少ない等の場合には、これより薄く1×10^5cells/ml程度でも可能です。
細胞懸濁液はメッシュフィルターを通すべきですか? 装置で測定する直前に、30-40um程度の孔径のメッシュフィルターを通して凝集した細胞を取り除いてください。大きな凝集は流路の詰まりの原因となります。また、ソーティングの純度・回収率の低下を引き起こす可能性があります。
細胞懸濁・回収用バッファーには何を使用するべきですか?

生存率向上のため、2% FBSまたは0.5% BSAを含むPBSやHBSSを推奨いたします。細胞の凝集防止のため、2mM EDTA(最終濃度)を添加することもご検討ください。

培地もご使用可能ですが、長時間ソーティングを行いますとpHが変化し、細胞へのダメージが懸念されます。

細胞回収用チューブにはどれくらいの量のバッファーを入れればよいですか? 細胞へのダメージを防ぐため、回収用チューブにはチューブ全量の半分程度のバッファーを入れることを推奨します。

解析・ソート

Question Answer
どのソーティングチップを使用すればよいですか?

下図を参考に適切なソーティングチップをご使用ください。

流路の詰まりを防止し、ソーティング精度を確保するため、オリフィス径の20%以下(目安)の細胞サイズを推奨します。

特に大きい細胞を測定する際は130 umチップ、多量の細胞を短時間でソーティングされたい場合はソーティング速度の速い70 umチップを推奨します。

適切なSample Pressureの設定方法を教えてください。

低いSample Pressureではサンプルからの流れが細くなるため、得られるピークが鋭くなります。

細胞の大きさに対してSample Pressureが低すぎると、Event Rateが不安定になります。

小さい細胞には低いSample Pressure、大きい細胞には高いSample Pressureと、細胞の大きさに合わせて至適なSample Pressureに設定してください。

コンペンセーションとは何ですか?どのようにすればよいのでしょうか?

蛍光色素の蛍光には波長分布があるため、光学フィルターで分離した各波長域の光は目的の蛍光色素以外の色素由来の蛍光の漏れ込みも含んでいる状態で検出されています。そのため、2色以上の蛍光測定時には、他の蛍光検出器への漏れこみの補正(コンペンセーション) を行う必要があります。

コンペンセーションを行うためには、無染色コントロールとそれぞれの色素の単染色コントロールをご用意ください。

弊社セルソーターでは、ウィザードを使用したオートコンペンセーションと、マニュアルコンペンセーション、どちらも実施していただくことができます。

コンペンセーションに用いるコントロールサンプルは何を使えばよいですか? 測定する細胞と同じ細胞のご使用を推奨します。無染色コントロールには、蛍光色素を何も添加していないサンプルをご使用ください。
ダブレット除去とはどのようにすればよいのでしょうか?

ダブレット(凝集した細胞)をそのままソーティングしてしまうと、純度の低下を引き起こす原因になります。

ダブレットは、測定パラメータのパルス高さ(Height)またはパルス幅(Width)と、パルス面積(Area)を同時に用いることで検出可能です。ダブレットを除いたシングレットゲートをソーティングに使用してください。

ソーティング中にEvent Rateが不安定になるのですが。

以下をご検討ください。

  • 細胞が凝集している可能性があります。測定の直前に細胞懸濁液をメッシュフィルターを通してください。
  • Sample Pressureの設定値を上げてください。
  • サンプルラインのピンチバルブ部分をもみほぐしてください。
  • サンプルラインの洗浄(ブリーチクリーニング、DIリンス)をしてください。
ソーティングした細胞を培養したいのですが、生存率を向上させるにはどうしたらよいですか?

以下をご検討ください。

  • 回収用チューブに十分量のバッファーを入れてください。
  • 細胞懸濁・回収用バッファーとして、2% FBSまたは0.5% BSAを加えたPBSやHBSSを使用してください。
  • 細胞の最適温度を保持してください。弊社セルソーターでは、サンプルチューブを5℃または37℃、コレクションチューブを5℃に設定していただくことが可能です。
  • 市販のシース液には微量の防腐剤等が含まれています。チューブに多量の細胞をソーティングする場合は、ソーティング後の細胞が入ったチューブから速やかにシース液成分を除去することで、生存率が向上する可能性がございます。

サンプル/コレクション温度調整

[Cytometer]タブの[Temperature Control]から設定可能です。

シングルセルソーティングの際の留意点を教えてください。

以下をご検討ください。

  • ゲート設定によりダブレットを除去してください。
  • 細胞回収用プレートにはあらかじめ200uL程度の培地を添加してください。
  • Sort modeをSingle cell modeに設定してソーティングを行ってください。
  • ソーティング後に培養される際は、生存率が重要になってきますので、よりソーティング時の落下速度の遅い130umチップを使用すると改善する可能性がございます。

※シース液には多少の細胞毒性がございますが、上記条件でソーティングされる場合、1ウェル内に入るシース液量は微量なため、シース液の除去は不要と考えられます。

参考:アプリケーション「セルソーターSH800Sによる細胞ソーティング後のシングルセル培養生存率を高めるための最適化」 (PDF)

ソーティング時に設定した細胞数よりも、ソーティング後に計数した細胞数が少ないのですが。

ソーティング後に細胞のロスが発生している可能性があります。以下をご検討ください。

  • 細胞の吸着を抑えるため、回収用チューブとしてPP(ポリプロピレン製)のチューブをご使用ください。
  • バッファーに2% FBSまたは0.5% BSAを添加することで、より細胞の吸着を抑えることが可能です。
  • ソーティング後の細胞の遠心条件をご検討ください。
  • 静電気防止のため、作業前に細胞回収用チューブの内壁をバッファーで軽く湿らせることも有効です。
バクテリアなどの小さいサイズのサンプルを解析するときの留意点を教えてください。

FSC, BSCのGainを上げ、Threshold Valueの設定値を下げてください。このときにPauseをクリックし0 epsになっていることを確認してください。

散乱光プロットの軸表示をLogに設定するとより見やすくなります。

参考:アプリケーション「セルソーターSH800Sヨーグルト中の生きた乳酸菌ソーティング」 (PDF)

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